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21 maio, 2018 • 5:29 Enviado por Dinler Antunes

Explicando reatividade cruzada com base na análise estrutural de complexos pMHC

Autor: Dinler Amaral Antunes, Bacharel em Biomedicina pela UFRGS, Mestrado e Doutorado pelo PPGBM/UFRGS e pós-doutorado pela Rice University (Texas/EUA).

 

Em um dos primeiros posts que fiz para o SBlogI, ainda em 2014, eu apresentei uma metodologia para agrupar complexos peptídeo-MHC (pMHC) de acordo com sua similaridade estrutural [1]. A ideia central era utilizar este método para predizer reatividade cruzada de linfócitos T. Reatividade cruzada se refere a capacidade de um linfócito T reconhecer outros complexos pMHC não relacionados (heterólogos), além do pMHC para o qual o linfócito foi inicialmente estimulado (alvo cognato) [2]. Várias bases moleculares foram propostas para explicar reatividade cruzada, incluindo mímica molecular, reconhecimento alternativo e até a ocorrência de dois receptores (TCR) diferentes no mesmo linfócito, conforme ilustrado na figura a baixo [Figura publicada em 2]. A visão prevalente era de que reatividade cruzada ocorria por mímica molecular e que poderia ser predita com base na similaridade de sequência dos peptídeos envolvidos.

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Embora reatividade cruzada fosse um fenômeno bem conhecido na área de imunidade antiviral, ela não era considerada um fenômeno prevalente em outras áreas da imunologia [3, 4]. Havia um certo ceticismo com relação aos resultados de reatividade cruzada. Dadas as limitações dos métodos experimentais e o fato de muitos experimentos serem baseados em respostas policlonais (experimentos in vivo), sempre havia o questionamento de que talvez a reatividade cruzada observada não fosse o perfil de resposta de um linfócito “promíscuo”, mas a sobreposição da resposta de dois ou mais linfócitos “monogâmicos”. Um dos motivos para ceticismo era a falta de reprodutibilidade de alguns resultados [3]. Por exemplo, um grupo descrevia que existia reatividade cruzada entre os epitopos A e B, derivados de dois vírus diferentes e apresentados pelo mesmo MHC. Outro grupo tentava reproduzir este experimento e concluía que esta reação era rara, ou que só acontecia em um determinada direção (ex., imunização com A produz linfócitos que também reconhecem B, mas imunização com B produz linfócitos que não reconhecem A) [5, 6].

Com a evolução dos métodos experimentais se tornou possível garantir que os experimentos estão sendo conduzidos com um único linfócito (clones), e se tornou possível desenhar experimentos para quantificar a prevalência de eventos de reatividade cruzada [7,8]. A conclusão é de que reatividade cruzada é muito mais comum do que imaginávamos. Linfócitos são bastante promíscuos e podem reconhecer peptídeos com sequências muito diferentes [8]. Definitivamente existe uma relação com similaridade estrutural de pMHCs, embora outros mecanismos sejam possíveis [8]. E as implicações deste fenômeno não estão restritas a imunidade antiviral, sendo por exemplo uma das principais preocupações quanto a segurança de imunoterapias contra o câncer [3]. Um exemplo marcante foi observado em estudos clínicos com linfócitos específicos contra melanoma. Estes linfócitos foram modificados para aumentar sua afinidade por um peptídeo específico de melanócitos e testes de citotoxicidade não demonstraram reconhecimento de nenhum outro tecido saudável [9]. Infelizmente, em alguns dos pacientes tratados com estes linfócitos houve reconhecimento de um peptídeo derivado da proteína titina, expresso em células cardíacas saudáveis [9]. Esta reatividade cruzada levou a morte de pelo menos cinco pacientes que estavam sendo tratados para melanoma. Estudos posteriores determinaram a estrutura cristalográfica dos complexos envolvidos e demonstraram grande similaridade estrutural, a despeito da diferença de sequência entre os peptídeos envolvidos [10].

Mas uma das revelações mais importantes talvez seja o fato de que a reatividade cruzada não é unicamente determinada pelos peptídeos envolvidos, ou mesmo pela estrutura dos complexos pMHC. Definitivamente isso importa, mas este é apenas um lado da história. A ocorrência e as peculiaridades de uma resposta cruzada dependem também de qual linfócito está sendo utilizado [3].

Por exemplo, a figura abaixo [Publicada em 3] apresenta uma representação esquemática de padrões alternativos de reatividade cruzada apresentados por dois linfócitos distintos (dados experimentais).

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Se usarmos o linfócito “azul”, específico para um peptídeo derivado da proteína A11 do vírus vaccinia (VV-A11-198), observamos reatividade cruzada contra peptídeos de outros vírus, mas não observamos reatividade cruzada contra um peptídeo da proteína E7 do vaccinia (VV-E7-130). Por outro lado, se repetirmos o experimento utilizando uma população distinta de linfócitos (“rosa”), o padrão muda. Agora observamos reatividade cruzada com E7, mas não observamos reatividade cruzada contra a maioria dos outros peptídeos. Em ambos os casos estamos utilizando os mesmos peptídeos e o mesmo MHC, só o que mudou foi o linfócito. E isso explica em grande parte o problema de reprodutibilidade de resultados de reatividade cruzada mencionado anteriormente [3].

Observe que em ambos os experimentos foi verificada reatividade cruzada entre VV-A11-198 e LCMV-GP-34. O que há de especial neste par de complexos? Em uma publicação na revista Frontiers in Immunology nós revisamos a literatura na área de reatividade cruzada e propomos hipóteses sobre como características estruturais dos complexos pMHC podem influenciar eventos de reatividade cruzada [3]. No exemplo acima, a explicação seria uma maior similaridade estrutural entre VV-A11-198 e LCMV-GP-34. Para testar esta hipótese nós analisamos a superfície molecular destes complexos (além de outros controles negativos), usando estruturas experimentais e modelos computacionais.  Nós extraímos dados estruturais destas superfícies e agrupamos os complexos de acordo com sua similaridade.

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Na imagem acima [Publicada em 3], a altura dos “nós” do gráfico (números em cinza) indicam a similaridade entre os complexos conectados (quanto menor a altura, maior a semelhança). Os números vermelhos e verdes indicam a confiabilidade de cada agrupamento, usando duas métricas distintas. Este resultado confirma que os dois complexos mais semelhantes neste conjunto são VV-A11-198 e LCMV-GP-34. Mais do que isso, estes resultados mostram uma reprodução parcial dos diferentes padrões de reatividade cruzada observados na figura anterior. Ou seja, a célula “rosa” é menos “promíscua”, reconhecendo um conjunto menor de complexos. Enquanto a célula “azul” reconhece um conjunto mais heterogêneo de alvos.

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Outro aspecto da reatividade cruzada que pode ser explicado pela análise estrutural é a direcionalidade. A figura acima [Modificada de 3] apresenta três complexos envolvidos em reatividade cruzada, e as setas indicam a direção na qual a reatividade cruzada foi observada. Existe reciprocidade entre os complexos B e C, mas o mesmo não ocorre entre os complexos A e B. Observe que o complexo A possui uma proeminente carga negativa (indicada pela seta verde) que o distingue dos demais complexos. Dados recentes indicam que ao invés de considerar toda a informação estrutural do pMHC, o reconhecimento pelos linfócitos é determinado por poucas interações dominantes (“hot-spots”) [7]. Assim, linfócitos estimulados com o complexo B reconhecem padrões estruturais mais comuns, que também estão presentes em A e em C; permitindo a reatividade cruzada. Por outro lado, a resposta contra o alvo A é provavelmente dominada por linfócitos que reconhecem esta saliente carga negativa. Como esta carga não está presente nos demais complexos, não ocorre reatividade cruzada contra eles. No entanto, em tese, estes linfócitos poderiam apresentar reatividade cruzada contra outros alvos que compartilham esta carga negativa.

Predição de reatividade cruzada é uma tarefa bastante complicada. Nosso grupo vem trabalhando com métodos de agrupamento hierárquico conforme discutido aqui e em postagens anteriores [1, 11]. Mas este tipo de predição está em certa medida limitada pelo número de estruturas disponíveis em bancos de dados [12]. Métodos baseados em alinhamento de sequência permitem análise em escala proteômica [13, 14], mas a falta de informação estrutural limita muito a capacidade preditiva destes métodos [12]. Novas estratégias combinando aspectos de ambos os métodos são necessárias para que a predição de reatividade cruzada se torne uma rotina no desenvolvimento de vacinas e na imunoterapia contra o câncer [3].  

Referências:

  1. http://sbi.org.br/imunologia-molecular-in-silico-parte-iii/
  2. https://www.nature.com/articles/nri820#f1
  3. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2017.01210/full
  4. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2016.00089/full
  5. http://jvi.asm.org/content/75/23/11392.long
  6. https://www.jci.org/articles/view/33082
  7. https://www.nature.com/articles/ni.3310
  8. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092-8674(14)00476-0
  9. http://www.bloodjournal.org/content/122/6/863?sso-checked=true
  10. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4725365/
  11. http://sbi.org.br/na-rota-para-uma-ferramenta-de-predicao/
  12. https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-016-1150-2
  13. https://academic.oup.com/bioinformatics/article/33/1/104/2525678
  14. https://academic.oup.com/bioinformatics/article/31/11/1854/2365676