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12 junho, 2014 • 3:30 Enviado por Dinler Antunes

Imunologia molecular In silico – Parte III

 Clusterização Hierárquica e
Reatividade Cruzada
A reatividade cruzada de Linfócitos
T Citotóxicos (CTLs) é um fenômeno no qual uma mesma população de células CD8+ é capaz de reconhecer e responder contra dois ou
mais alvos distintos (um mesmo TCR interage fortemente com mais de um complexo
peptídeo:MHC). Esta característica dos CTLs tem aplicações diretas no
desenvolvimento de vacinas e em outras áreas da imunologia. Conforme revisado
na primeira parte deste post, houve
algumas iniciativas de predição de reatividade cruzada baseadas nas sequências
dos peptídeos apresentados (Frankild, 2008; De Groot, 2013), mas a compreensão e predição destes padrões de
resposta têm se mostrado um desafio muito complexo.
Em um estudo publicado em 2008,
uma equipe coordenada pelos pesquisadores alemães Heiner Wedemeyer e Markus
Cornberg imunizou um indivíduo saudável com a vacina experimental IC41 (Fytili e cols., 2008). Esta vacina continha um epitopo imunogênico da proteína NS3 do
Vírus da Hepatite C (HCV-NS31073), cuja sequência de aminoácidos era
“CINGVCWTV”. Conforme esperado, a vacina induziu a geração de CTLs específicos para
este alvo. Em seguida, os pesquisadores recuperaram estes linfócitos e os
desafiaram in vitro contra 28
variantes naturais do epitopo HCV-NS31073, cobrindo os seis
genótipos de HCV. A resposta contra a sequência selvagem “CVNGVCWT” do Genótipo
1 (G1-01), que apresenta alta reatividade cruzada com o epitopo vacinal, foi
considerada o controle positivo. De acordo com os autores, foi observada uma
importante reatividade cruzada com os alvos dos genótipos 4, 5 e 6, bem como
com algumas variantes do genótipo 1. Por outro lado, uma fraca resposta foi
observada contra os alvos dos genótipos 2 e 3. Em especial, o epitopo G3-18
(“TVGDVMWTV”) foi o único que aboliu completamente o reconhecimento pelos CTLs
utilizados no ensaio (Figura 1A).
Figura 1. Comparação entre
resultados in vitro e a análise
estrutural in silico. (A) Resultados
de um ensaio in vitro realizado por
Fytili e cols., 2008, no qual uma mesma população de CTLs – específica contra a
sequência selvagem do epitopo HCV-NS31073 – foi desafiada contra 28
variantes naturais deste alvo. (B-I)
Recorte da área de interação com o TCR de alguns destes epitopos, no contexto
do HLA-A*02:01, após modelagem pela técnica D1-EM-D2
(Antunes e cols., 2010). Áreas carregadas são apresentadas em azul (positivas) e
vermelho (negativas), em uma escala de -10 kT a +10 kT. Complexos com forte
reatividade cruzada apresentam grande semelhança estrutural (B-E), enquanto
complexos com fraca resposta cruzada (F-I) apresentam diferenças no potencial
eletrostático (setas verdes). Modificado de Antunes e cols., 2011.
Conforme apresentado na segunda parte deste post, o nosso grupo
desenvolveu uma abordagem para a predição estrutural de complexos pMHC e
começou a observar a distribuição do potencial eletrostático na superfície
destes complexos. Em um trabalho publicado em 2011, foi realizada a modelagem
destes 28 complexos apresentando variantes de HCV no contexto do MHC humano
HLA-A*02:01 (Antunes e cols., 2011). Observando a superfície destes complexos,
ficou clara a semelhança estrutural entre aqueles que apresentavam reatividade
cruzada, em termos de topografia e distribuição de cargas (Figura 1B-E). Por
outro lado, os complexos com fraca resposta cruzada apresentavam diferenças no
potencial eletrostático, o que era especialmente visível no caso do complexo
G3-18 (Figura 1I).
Na tentativa de quantificar estas
relações de similaridade, nós delimitamos uma região nas imagens dos complexos
e extraímos valores relativos ao histograma de cores (RGB). Estes valores foram
utilizados como entrada para uma análise de componentes principais (PCA) que
foi capaz de reproduzir os agrupamentos observados in vitro (Figura 2). Observe que, de acordo com o PC1 (que explica
a maior parte da variabilidade dos dados), foi possível agrupar todos os
complexos do genótipo 3 (G3) em um determinada faixa de valores. Os complexos do genótipo
2 ocupam outra faixa, na qual também se encontram os
“mau-respondedores” do genótipo 1. Todos os complexos que apresentaram elevada
reatividade cruzada se agrupam em uma faixa distinta, dominada pelos complexos
do genótipo 6. Nós também incluímos nesta análise um epitopo de Influenza
(IV-NA231), cuja reatividade cruzada com o HCV-NS31073
havia sido descrita previamente (Wedemeyer e cols., 2001), observando que o
mesmo se localiza ao lado do epitopo selvagem de HCV.
Figura 2. Distribuição dos
complexos de acordo com uma Análise de Componentes Principais (PCA). O único complexo que não apresentou
resposta in vitro aparece completamente isolado (G3-18). A
distribuição de acordo com o PC1 permite observar faixas que agrupam os
complexos do genótipo 3 (G3), os complexos do genótipo 2 (G2) e os
complexos do genótipo 6 (G6). O epitopo IV-NA231, previamente descrito como alvo de reatividade cruzada com o epitopo
HCV-NS31073, também se localizou junto ao grupo G6. Modificado de Antunes e cols., 2011.

        Os mesmos resultados foram observados utilizando-se outra abordagem
estatística, a análise de clusterização hierárquica (HCA). O HCA também
apresentava algumas vantagens práticas para a análise de um volume maior de
dados, fornecendo um dendrograma das relações de similaridade entre os
complexos. Foi então realizada uma triagem virtual de 55 complexos pMHC não
relacionados, incluindo os pMHCs “cross-reativos” de HCV, mas também vários
outros pMHCs disponíveis no CrossTope. Para esta abordagem foram utilizados
valores de 7 regiões de variabilidade na superfície do pMHC (compatíveis com os
footprints dos TCRs), os quais
serviram para agrupar os complexos através do HCA (Antunes e cols., 2011).

Conforme esperado, o dendrograma resultante apresentou um agrupamento
principal contendo as variantes de HCV. No entanto, este
cluster de HCV” incluía novos complexos. Dois deles se destacaram pela
semelhança estrutural com o HCV-NS31073: o HIV-GAG77
(SLYNTVATL) e o EBV-LMP2329 (LLWTLVVLL). Observe que o epitopo de EBV
não compartilha nenhum aminoácido com o epitopo selvagem de HCV e que, no
entanto, apresentou uma superfície muito semelhante no contexto do HLA-A*02:01.
A possível reatividade cruzada entre HCV-NS31073 e EBV-LMP2329 não havia sido descrita e este alvo dificilmente
teria sido sugerido por qualquer análise baseada em sequência.
Intrigados por nossa predição, o grupo do Professor Markus Cornberg
resolveu testar estes alvos, utilizando estimulação ex vivo de linfócitos de pacientes HCV+ e avaliando o
reconhecimento dos peptídeos através da marcação intracelular de Interferon-γ e
citometria de fluxo. Estes estudos, ainda não publicados, confirmaram a
reatividade cruzada entre os alvos HCV-NS31073 e EBV-LMP2329,
apresentando importantes implicações para o estudo da evolução da infecção por
HCV (Zhang, S., comunicação pessoal).
Encerramos assim esta jornada pelas pesquisas desenvolvidas pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI). Nos próximos posts abordarei outras novidades desta
nova fronteira da Imunologia, a “Imunoinformática”. Um Feliz dia dos Namorados
a todos (especialmente à Stertz, L.) e boa sorte para a seleção brasileira que
estreia hoje no mundial de 2014!!
Post de Dinler Amaral Antunes
NBLI – Núcleo de Bioinformática do Laboratório de
Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética
e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(PPGBM/UFRGS).