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28 maio, 2018 • 7:00 Enviado por Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia (EPM-UNIFESP)

Os homens são de Marte, a Esclerose Múltipla é de Vênus… Culpa da IL-33?

Por Filipe Menegatti de Melo, PhD.

Pós-Doutorando do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp)

 

Editor-chefe: Alexandre S. Basso.

 

A esclerose múltipla (MS), assim como seu modelo murino experimental (a Encefalomielite Autoimune Experimental – EAE), é uma doença autoimune caracterizada pela desmielinização do Sistema Nervoso Central (SNC), o que leva a uma série de déficits motores e cognitivos. Apesar da etiologia da doença ainda não estar completamente esclarecida, é consenso que MS/EAE é iniciada pela infiltração do SNC por células T CD4+ autorreativas contra antígenos da bainha da mielina; tais células T são principalmente de perfil Th1 e Th17. Ao longo do curso da doença, outras células são recrutadas, tais como neutrófilos, monócitos e células B [1, 2].

 

Assim como ocorre com outras doenças autoimunes, a MS apresenta uma incidência de 3 a 4 vezes maior em mulheres do que nos homens. Além disso, há diferenças entre a idade de aparecimento dos sintomas e do curso clínico da doença [3]. As mulheres costumam apresentar sintomas em idade mais precoce do que os homens e apresentam uma doença principalmente do tipo surto-e-remissão, enquanto os homens podem apresentar com mais frequência que as mulheres uma MS do tipo crônica-progressiva. Uma doença do tipo surto-e-remissão caracteriza-se por surtos que duram de dias a semanas; dependendo da área do SNC onde ocorre o ataque inflamatório, podem ocorrer sintomas de debilidades visuais, motoras ou mesmo perturbações autonômicas que comprometem o funcionamento da bexiga e do intestino. Na remissão, ainda observa-se certo grau de debilidade residual. Com o passar dos anos, as debilidades se acumulam e a doença deixa o padrão surto-e-remissão e se cronifica, além de progredir [4].

 

Ainda estão pouco claros os fatores que contribuem para essas diferenças entre homens e mulheres, havendo estudos que estabelecem relações com a dosagem do cromossomo X, diferenças na microbiota e nos hormônios sexuais [3]. No caso da influência hormonal, um artigo recentemente publicado na revista Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS) pelo grupo da Professora Melissa A. Brown (Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago) mostrou que a IL-33, cuja produção por mastócitos é regulada pela testosterona, é um fator de proteção contra MS/EAE em machos por contribuir para a diferenciação de uma resposta mielina-específica do tipo Th2 não-patogênica [5].

 

O grupo da Professora Brown utilizou o modelo de EAE em camundongos SJL, nos quais a incidência e o curso da doença são marcantemente diferentes entre animais machos e fêmeas. Nesse modelo de EAE, os animais são imunizados com peptídeo derivado da proteolipoproteina da mielina (PLP139-151) emulsificado em Adjuvante Completo de Freund (CFA). Inicialmente, o grupo observou que animais SJL fêmeas que desenvolviam ativamente a EAE após a imunização apresentavam células PLP139-151-específicas de perfil Th17 tanto nos linfonodos drenantes quanto infiltrando o SNC. Já os animais machos apresentavam células de perfil Th2 nos dois sítios, e não apresentavam sintomas da doença (ou apresentavam sintomas apenas das fases iniciais).

 

Em trabalho anteriormente publicado [6], o grupo observou que os machos SJL resistentes a EAE apresentavam acúmulo de células linfoides inatas do tipo 2 (ILC2s) tanto nos linfonodos drenantes do sítio de imunização quanto no SNC. Camundongos SJL machos que apresentavam mutação em c-kit (KitW/Wv), que apresentavam defeitos no desenvolvimento tanto de ILC2s quanto de mastócitos, desenvolviam resposta Th17 a apresentavam EAE. No artigo do PNAS, o grupo focou novamente nas ILC2s e observou que há um aumento discreto nas frequências dessas células nos linfonodos drenantes de machos imunizados com CFA+PLP139-151 em comparação com as fêmeas (análise realizada 6 dias após a imunização); essa diferença se mostrou muito mais marcante na análise do SNC no 14º dia de imunização (pico da EAE), sendo que a frequência de ILC2s no SNC de machos era entre 3 e 4 vezes maior do que a frequência das mesmas células no SNC das fêmeas (normalizada pelo total de células CD45high). Apesar dessas diferenças, os autores não encontraram diferenças significativas entre as frequências de precursores de ILC2s tanto na medula quanto no timo de machos e fêmeas, ou mesmo nas frequências dessas células no steady state em alguns tecidos analisados. Ainda, ILC2s purificadas da medula óssea e re-estimuladas ex vivo apresentavam a mesma capacidade proliferativa e os mesmos níveis de expressão de IL-5, IL-13, IL-4 e IL-9, independente do sexo do qual provinham as células.

 

Os autores então se perguntaram se as diferenças de frequências de ILC2s entre machos e fêmeas na EAE não se deviam a uma menor expressão de IL-33 pelas fêmeas, sendo que essa citocina é um importante ativador das ILC2s. A expressão do receptor de IL-33 pelas ILC2s foi inclusive utilizada pelos autores do paper para diferenciar ILC2s de ILC1s (relacionadas a resposta Th1) e ILC3s (resposta Th17). ILC2s foram analisadas por citometria utilizando-se a seguinte estratégia de gate: CD45high Lin IL-7Rα+ e ST2+, sendo ST2 um dos componentes do receptor de IL-33; ILCs de outros tipos foram consideradas ST2.

 

Foi detectado por qPCR um aumento na expressão de IL-33 nos linfonodos drenantes, na medula espinhal e no cérebro de camundongos SJL machos no dia 6 pós-imunização. Esse aumento não for observado quando os animais foram injetados somente com CFA+PBS, mostrando que a produção de IL-33 acontecia somente após a indução de uma resposta de células T. Essa produção de IL-33 era realizada por mastócitos, uma vez que não foi observada nos animais KitW/Wv machos, e era restaurada quando esses animais mutantes recebiam transferência adotiva de mastócitos derivados de precursores de medula óssea. Analisando-se as populações celulares das meninges de machos e fêmeas 6 dias após a imunização, os autores observaram que não havia diferenças significativas nas frequências de mastócitos entre os sexos, porém havia maior frequência de mastócitos produtores de IL-33 nos machos e, individualmente, tais células também produziam mais IL-33 (conforme indicado por um maior MFI nas células dos animais machos).

 

Os autores então postularam que, se uma baixa expressão de IL-33 nas fêmeas era a responsável por uma resposta diminuída de ILC2s e, consequentemente, susceptibilidade a EAE, então o tratamento com essa citocina deveria proteger os animais fêmeas. De fato, o tratamento de diferentes grupos de fêmeas com diferentes doses de IL-33 (administrada pela via intraperitoneal) na fase pré-clínica da EAE promoveu uma atenuação dos sintomas de forma dose-dependente, com ausência de doença no grupo que foi tratado com 300ng de citocina. Tal proteção correlacionou-se com aumento nas frequências de ILC2s e células Th2 tanto nos linfonodos quanto no SNC. Além disso, o tratamento com IL-33 em animais já desenvolvendo a doença (score clínico de 1,5) impediu o surgimento de recidiva (nova fase de surto) cerca de 30 dias após a imunização, fenômeno que também estava correlacionado ao aumento de ILC2s no SNC e mudança no balanço Th2/Th17 das células T CD4+ infiltrantes (Figura 1).

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Figura 1: (F) Esquema de tratamento das fêmeas SJL desenvolvendo EAE (score 1,5) com IL-33; (G) Curvas de evolução clínica de EAE de fêmeas tratadas e não tratadas com IL-33; o período entre os dias 31 e 50 pós-imunização indica um fase de recidiva (novo surto); (H) Citometria de fluxo para análise de ILC2s infiltrantes do SNC no 33º dia pós-imunização; (I) Frequência das ILC2s normalizada pelo total de células CD45high do SNC no 33º dia pós imunização; (J) Análise de populações de células T CD4+ infiltrantes do SNC no 33º dia pós-imunização, produtoras de IL-4 e IL-17, por meio de marcação intracelular de citocina e análise por citometria de fluxo. Excerto da Figura 4 do artigo publicado por Russi et al, 2018 [5].

 

Finalmente, os autores foram avaliar se a testosterona poderia influenciar na expressão da IL-33 pelos mastócitos. Em primeiro lugar, verificou-se que tanto mastócitos de machos quanto de fêmeas expressavam o receptor de andrógeno (AR), não havendo diferenças entre os sexos na expressão do receptor pelos mastócitos derivados de medula, porém havendo uma expressão maior nos mastócitos peritoneais dos machos. Quando mastócitos de medula foram cultivados na presença de concentrações crescentes de testosterona, observou-se que havia um aumento dose-dependente na expressão de IL-33 apenas pelos mastócitos provenientes dos machos (efeito que era parcialmente revertido com uso de antagonista do AR, flutamida). Os autores, no entanto, não buscaram o mecanismo pelo qual essa produção se deu apenas nos machos (haja vista que a expressão de AR pelos mastócitos era semelhante entre os sexos) e apenas argumentaram que outros mecanismos adicionais (por exemplo, regulação da cromatina) podem explicar essa diferença. A expressão de IL-33 também só foi observada em mastócitos de medula de machos mesmo quando tais células foram ativadas com Mtb (extrato de M. tuberculosis desidratado) ou cross-linking dos receptores FcεRI com anticorpo anti-IgE, ao passo que os mastócitos de fêmeas produziram IL-1β e TNF em resposta aos mesmos estímulos.

 

Em resumo, os resultados do artigo permitem estabelecer o modelo do dimorfismo sexual de EAE em camundongos SJL que está esquematizado na Figura 2 abaixo. Em camundongos SLJ machos, a testosterona estimula a produção de IL-33 que, por sua vez, contribui para a ativação de ILC2s e outras células produtoras de citocinas como IL-4 e IL-13. Na presença dessas citocinas, a diferenciação de células T CD4+ mielino-específicas se dá em direção a um perfil Th2 não patogênico. No caso das fêmeas, a concentração de testosterona circulante reduzida estimula a produção de IL-1β e TNF pelos mastócitos e outras células, o que contribui para a geração de uma resposta Th17 patogênica.

 

Os autores argumentam também que a diminuição da testosterona com o envelhecimento pode ser, portanto, uma possível explicação para o aparecimento de MS em homens mais idosos. Além disso, os autores compararam os níveis de testosterona séricos dos camundongos SJL e dos camundongos C57Bl/6 e observaram que essa última linhagem produz menos testosterona do que os SJL, o que poderia ser uma possível explicação para o fato de, nos C57Bl/6, a EAE se desenvolver em machos e fêmeas (muito embora, nos camundongos C57Bl/6 machos, a EAE apareça de forma mais branda que nas fêmeas, sendo que os machos não atinjem o score clínico máximo). Finalmente, os autores argumentam que a IL-33 e outras terapias que estimulem a ativação de ILC2s (ou suprimam as outras ILCs) são estratégias promissoras para o tratamento da esclerose múltipla.

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Figura 2: Modelo proposto com base nos resultados do artigo. Figura 6 do artigo publicado por Russi et al, 2018 [5]. Descrição no texto.

 

Referências:

  1. Rangachari, M. and V.K. Kuchroo, Using EAE to better understand principles of immune function and autoimmune pathology. J Autoimmun, 2013. 45: p. 31-9.
  2. Nylander, A. and D.A. Hafler, Multiple sclerosis. 2012.
  3. Khalid, R., Contributing factors in multiple sclerosis and the female sex bias. Immunol Lett, 2014. 162(1 Pt A): p. 223-32.
  4. Steinman, L., Immunology of relapse and remission in multiple sclerosis. Annu Rev Immunol, 2014. 32: p. 257-81.
  5. Russi, A.E., et al., Male-specific IL-33 expression regulates sex-dimorphic EAE susceptibility. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(7): p. E1520-e1529.
  6. Russi, A.E., et al., Cutting edge: c-Kit signaling differentially regulates type 2 innate lymphoid cell accumulation and susceptibility to central nervous system demyelination in male and female SJL mice. J Immunol, 2015. 194(12): p. 5609-13.